微生物工程實驗報告 - 下載本文

實驗1 培養基的配制和滅菌

一、目的要求

1.了解培養基的配制原理和方法,掌握其配制過程。

2.了解幾種滅菌方法,掌握高壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。 3.熟悉菌種分離篩選的前期準備工作及操作方法。 4.每2人一組,每人一份實驗報告。 二、實驗材料

1.藥品:酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、1N HCl、1N NaOH

2.設備:高壓蒸汽滅菌鍋、紫外線滅菌燈、75%酒精棉。

3.材料:天平、藥匙、電爐、pH 試紙、燒杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、試管、培養基、吸管、移液器(1mL 0.2mL)、牛皮紙、線繩、標簽等。 三、實驗內容 (一) 培養基的配制 1.培養基的配制方法和步驟

1)稱量:按照配方正確稱取所需藥品放于燒杯中。 2)溶化:在燒杯中加入所需水量,玻棒攪勻,加熱溶解。 3)調pH 值:用1N NaOH 或1N HCl 調pH,用pH 試紙對照。 4)加瓊脂溶化:加熱過程要不斷攪拌,可適當補水。 5)分裝:注意不要污染試管塞或紗布。 6)包扎成捆:用記號筆注明何種培養基。

7)滅菌:在高壓鍋中, 115 °C 高溫滅菌30min。 2.培養基的配制 A.富集培養基(液體):

海水2216E 液體培養基(g/L):蛋白胨5.0,酵母粉1.0,海水1L,pH 8.0。取50mL 分裝250mL 三角瓶后,8 層紗布封口,外包1層牛皮紙,121℃,高溫滅菌20min。 B. 2216E 斜面(固體):

海水2216E 液體培養基中加入2%的瓊脂粉,加熱溶化瓊脂,每支試管內。加入3mL,121℃高溫滅菌20min,滅菌后擺斜面。 C. 無菌生理鹽水和保種液:

生理鹽水: NaCl 0.85% 蒸餾水配制。

每支試管加入5mL,蓋上試管帽、包扎、121°C 高溫滅菌20min。 保種液:生理鹽水,加25%甘油 D. 碳源優化培養基:

以海水2216E 液體培養基(蛋白胨0.5%,酵母粉0.1%,磷酸鐵0.01%, 人工海水,pH7.6)為基礎,碳源分別是:葡萄糖、蔗糖、甘油、檸檬酸鈉、乳糖,每種碳源的添加量為1%。 (二) 分離培養微生物常用器皿的準備

1) 清洗一些玻璃儀儀器:如三角燒瓶、試管、培養皿等。 2) 制作8層紗布,酒精棉。

3)Tip 頭(0.2,1ml,分裝槍頭盒,牛皮紙包好,滅菌);保種管;藥勺;長竹簽。

4)衛生(308 實驗室超凈臺,實驗臺面) (三) 培養基和玻璃器皿的滅菌方法 1、加壓蒸汽滅菌法。其步驟如下:

1)滅菌鍋內加入一定量的水,將用防水紙包扎好的物品放入其中。 2)接通電源,進行加熱。

3)排除高壓鍋內的冷空氣,可將排氣閥打開,待排出冷空氣后關閉排氣閥;或關閉排氣閥,待壓力上升到0.5kg/cm2 時再打開排氣閥,待壓力回復到將近零時,再關閉排氣閥。

4)當壓力達15bl/in2(即1.05kg/cm2)時,此時滅菌鍋內的溫度為121℃,維持30min。對熱不穩定的培養基如含有葡萄糖、氨基酸等物時,應適當降低壓力,延長時間。

5)滅菌時間一到,切斷電源。待壓力降至零時,才能打開排氣閥,然后打開滅菌鍋蓋,取出物品。 2、紫外線滅菌

一般使用30W 燈管,9m3空間,距地面2m,打開紫外燈照射0.5h,可使室內空氣滅菌。若照射紫外線時先噴灑石炭酸等化學消毒劑,可增強滅菌效果。紫外線雖有較強的殺菌力,但穿透力弱,即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除,因此上適用于空氣表面殺菌。 3、化學藥劑消毒滅菌

微生物實驗室中常用的化學殺菌劑有酒精、甲醛、高錳酸鉀、石炭酸、漂白粉、新潔爾滅、來蘇爾、過氧乙酸等,它們有的是殺菌劑,有的是抑制劑。

四、思考題

1.固體培養基加瓊脂后加熱溶化時要注意哪些問題?

答:1)加熱器功率不能太高,也不能太低。太高,容易沸騰和把培

養基燒焦;太低,培養基容易凝固。

2)受熱要均勻,可以墊上石棉網,要用玻璃棒不停緩慢攪拌。 3)加熱完畢后,要在合適的溫度(60℃左右)倒平板,防止凝固。

2.培養基中加瓊脂的作用是什么? 答:充當固化劑,起支持作用 3.如何檢查培養基滅菌是否徹底?

答:把滅菌后的培養基,置25℃~30℃培養一周左右進行檢查。如果培養基沒有什么變化,說明滅菌效果良好;如果培養基出現了雜菌菌落,說明滅菌不徹底;如果大部分或全部菌種瓶都出現雜菌,說明滅菌溫度或滅菌時間不夠,應提高壓力或延長滅菌時間。經過幾次檢驗都證明已徹底滅菌后,以后按同樣條件滅菌的則不必進行檢查。

實驗二 產堿性蛋白酶海洋細菌的分離篩選

一、目的和要求

根據一定的實驗目的如酶類的生產,建立合適、精確的篩選模型,并從特定的樣品如海泥中篩選出高產菌株。

目的:加深對發酵工程上游技術中菌種選育的認識;學會常規選種和育種的方法,樹立科學認真仔細的態度,培養科研協作精神。 二、儀器與試劑

1. 儀器設備:滅菌鍋,培養箱,搖床,玻璃儀器(每組需用量)(已準備)

2. 需準備的培養基 A.富集培養基(液體):

海水2216E 液體培養基(g/L):蛋白胨5.0,酵母粉1.0,陳海水1L,pH7.6。取50mL 分裝250mL 三角瓶后,8層紗布封口,外包1層牛皮紙, 115℃高溫滅菌30min。 B. 2216E 斜面(固體):

海水2216E 液體培養基中加入2%的瓊脂粉,加熱溶化瓊脂,每支試管內加入5mL,115℃高溫滅菌30min,滅菌后擺斜面。 C. 無菌生理鹽水:

NaCl 0.85% 去離子水配制。每支試管加入4.5mL,蓋上試管帽、包扎、115℃高溫滅菌30min。

D. 堿性蛋白酶篩選培養基:海水2216E-脫脂奶粉平板:A:4%脫脂奶





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